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穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選與鑒定

簡要描述:利用哺乳動物系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白的方式有兩種:瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選。通過穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。針對瞬時轉(zhuǎn)染,外源基因在短時間轉(zhuǎn)錄翻譯得到的蛋白量較少,能夠滿足小量蛋白制備,大量生產(chǎn)成本很高。相對于此,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的是將外源基因整合到細(xì)胞自身的基因組上,隨著細(xì)胞的生長分裂外源基因可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá),同時經(jīng)過抗生素加壓篩選,最終得到能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白的細(xì)胞株,穩(wěn)轉(zhuǎn)株生產(chǎn)蛋白穩(wěn)定性更好,批次差異性更小。

  • 更新時間:2024-10-26 00:00:00
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詳細(xì)介紹

制備穩(wěn)轉(zhuǎn)株的實驗步驟

一.準(zhǔn)備及預(yù)實驗

1、確定細(xì)胞系相關(guān)信息:需包括如下內(nèi)容

細(xì)胞系名稱

細(xì)胞培養(yǎng)條件

細(xì)胞增殖速度

支原體污染情況

2、查閱慢病毒感染該細(xì)胞的MOI值

3、預(yù)實驗確定篩選藥物用量:

(1)查閱Puromycin/Blastincidin在目的細(xì)胞中穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的致死用量信息;參考查閱得到的數(shù)據(jù),確定3個藥物濃度梯度(如沒有相關(guān)信息,則需將藥物濃度梯度范圍增大,數(shù)量增多至6個);

(2)D0將細(xì)胞鋪于6孔板中,使D1細(xì)胞融合度約90%;D1按(1)中設(shè)置的藥物梯度,加入藥物;

(3)D4換液,并重新加入藥物;

(4)D7觀察,找到致死率100%的孔,該孔使用的藥物濃度,即為藥物篩選濃度。

二.穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選及構(gòu)建

注:以下實驗參數(shù),按1株穩(wěn)轉(zhuǎn)株為例描述,實驗需考慮有無對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株!

1、細(xì)胞鋪板:D0將細(xì)胞接種于6孔板中(4個孔),使D1細(xì)胞融合度約70%

病毒感染:

2、慢病毒上清:分別棄去6孔板中3個孔的0.5毫升培養(yǎng)基、1毫升培養(yǎng)基、2毫升培養(yǎng)基和,分別加入2毫升慢病毒上清、1.5毫升慢病毒上清和0.5毫升慢病毒上清;

3、純化慢病毒:選3個孔,并可按推薦MOI、大于此MOI及小于此MOI,共三個MOI值,添加慢病毒;

4、觀察感染效率:感染后72小時,觀察感染效率,效率高于80%最佳,最低不應(yīng)低于40%,選擇1-2個感染效率較好的孔。

5、篩選:

(1)多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株:從感染72小時后開始于6孔板中加篩選藥物,每隔2天,重新?lián)Q液加入藥物。藥物篩選需至少持續(xù)14天,直至顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞比例為100%。

注:第一次加入藥物時在上午進(jìn)行,4-6小時后觀察細(xì)胞狀態(tài),如細(xì)胞死亡過多,需更換新鮮不含藥物的培養(yǎng)基。

(2)單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株:建立在獲得多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株基礎(chǔ)上。

A、有限稀釋法:

a.取24個1.5毫升EP管,每管中加入800毫升完全培養(yǎng)基;

b.用胰酶將多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株消化(90%融合度,10毫升培養(yǎng)基終止消化),取80微升至第一個EP管中,混合均勻;

注:應(yīng)使用1000微升槍尖,混合時不要過度吸打,以免破壞細(xì)胞。

c.從第一個EP管中取80微升至第二個EP管中,混合均勻,以此類推。

d.將EP管中的細(xì)胞懸液,以每孔100微升,接種于96孔板中;

e.過夜培養(yǎng)后,觀察第12-24列,尋找只含有1個細(xì)胞的孔,并做好標(biāo)記;

f.培養(yǎng)3-4周,待標(biāo)記孔中細(xì)胞擴(kuò)增后,消化傳代擴(kuò)增,即為單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞。

注:培養(yǎng)的第一周不要換液,接下來每3-4天換液。

B、平板挑取法

a.計數(shù)100個多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞,接種于一個10cm培養(yǎng)盤中;

注:盡量吹打均勻,防止細(xì)胞聚團(tuán)。

b.過夜培養(yǎng)后,觀察并尋找單個細(xì)胞的位置,并在盤底做標(biāo)記;

c.培養(yǎng)2周;

注:培養(yǎng)的第一周不要換液,接下來每3-4天換液。

d.待標(biāo)記處的細(xì)胞擴(kuò)增為肉眼可見的白點,使用10微升移液器,調(diào)至最大量程,在尖端吸取一點胰酶(約5微升,且尖端為空氣),緩慢滴至白點處,保持槍尖靜置在白點上,且不讓胰酶留出白點所在范圍,1min后,迅速吹打,將消化下的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板中,傳代擴(kuò)增,即為單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞。約需2-3周。

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